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裂解液的使用方法
阅读次数:75  发布时间:2019/9/2 9:15:35

     裂解液的使用方法

    RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物,属正常现象。该透明胶状物为含有基因组
DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见的转录因子,例如NFκB、p53等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录因子
 
    对于培养细胞样品:
    1.融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的终浓度为1mM。
 
    2.对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞:离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。
裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。
 
    对于组织样品:
 
    1.把组织剪切成细小的碎片。
 
    2.融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的终浓度为1mM。
 
    3.按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
 
    4.用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
 
    5.充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
 
    6.如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

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