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HRP标记抗体原理及方法(戊二醛二步法和过碘酸钠法)
阅读次数:136  发布时间:2019/8/21 8:50:40

     酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否,因此被称为关键的试剂。酶标记物中*常用的是酶标记抗体,它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体,其次要有良好的制备方法。目前,高质量的酶(如辣根过氧化物酶,简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上,宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。

 
    一、酶制剂及其底物
    凡无毒性又能呈现有色化学反应的酶,原则上均可作为标记用。但作为标记抗体用的酶应满足下列要求:
 
 
    (1)来源方便,易于纯化;
 
 
    (2)比活性高,性质稳定;
 
 
    (3)酶活性和量能用简单方法测定。目前在免疫酶技术中常用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)和硷性磷酸酶(AP),其次还有葡萄糖氧化酶,β-半乳糖苷酶、溶菌酶和苹果酸脱氢酶等。
 
 
    由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,所以*常用。HRP广泛分布于植物界,辣根中含量高,它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白,糖含量18%。HRP由多个同功酶组成,分子量为40,000,等电点为PH3~9,酶催化的*适PH因供氢体不同而稍有差异,但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下饱和度硫酸铵溶液。HRP的辅基和酶蛋白*吸收光谱分别为403nm和275nm,一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的纯度。高纯度的酶RZ值应在3.0左右(*可达3.4)。RZ值越小,非酶蛋白就越多。值得注意的是,纯度并不表示酶活性,如当酶变性后,RZ值仍可不变。
 
 
    HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型染料,通过反应可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反应的过程如下:
 
 
                 HRP
         DH2+H2O2────→D+2H2O
    供氢体的种类很多,形成的产物特点不一。如DAB(3.3-二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物,并有电子密度,故适宜于做免疫酶染色或电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA,但其溶解度不够大,且空白孔不易控制到无色,现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高,但反应中受温度影响较大,而且由于产物不稳定,需要在短时间内进行测定。目前用得较广泛和较满意的供氢体是:OPD(邻苯二胺)和TMB(四甲基联苯胺)。前者形成的产物为深桔黄色或棕色,后者产物为蓝绿色,二者的可溶性均好,在避光处颜色稳定,空白可近于无色,灵敏度上据报道后者比前者可高4倍以上。另外,还有一种供氢体称ABTS[2, 2'-边氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)],其反应产物呈蓝绿色,且灵敏度和稳定性均好。尤其是在致癌的潜在可能性方面,ABTS与TMB皆是值得被优选的供氢体。
 
 
 
    由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂,因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰(说明H2O2已消耗殆尽)。这样即使再延长时间也不会增加反应产物颜色。
 
 
 
    二、HRP标记抗体的方法
    酶与抗体交联的方法有许多种,根据酶的结构不同可采用不同的方法。对于制备HRP结物,可用戊二醛二步法和过碘酸钠法。尤以简易过碘酸钠法更为常用。戊二醛二步法
 
 
    1.原理:戊二醛为一种双功能试剂,通过其醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基共价结合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白结合物。
 
 
    2.标记步骤:
 
 
    (1)称取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室温静置过夜。
 
 
    (2)反应后的酶溶液经Sephadex G-25层析柱,用生理盐水洗脱。流速控制在1ml/1分钟,收集棕色流出液。如体积大于5ml,则以PEG浓缩至5ml。放置25ml小烧杯中,缓慢搅拌。
 
 
    (3)将待标记的抗体12.5mg用生理盐水稀释至5ml,搅拌下逐滴加入酶溶液中。
 
 
    (4)用1M PH9.5碳酸缓冲液0.25ml,继续搅拌3小时。
 
 
    (5)加0.2M赖氨酸0.25ml,混匀后,置室温2小时。
 
 
    (6)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4℃1小时。
 
 
    (7)3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,*后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
 
 
    (8)将上述溶液装入透析袋中,对0.15M PH7.4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后(用萘氏试剂检测),10,000rpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,冰冻保存。
 
 
    3.结果判定:
 
 
    (1)定性及效价滴定:用特异性抗原(或抗体)同酶标记抗体(或抗免疫球蛋白抗体)作双向琼脂扩散试验或免疫电泳试验。然后用酶的底物使沉淀弧显色,可初步鉴定其活性。*后以直接ELISA法(或在正式实验系统里)对酶结合物进行滴定( 见本节 (三)工作浓度的选择)。
 
 
    (2)定量和克分子比值测定:可用分光光度计测定(光程1cm)。
   酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
   IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
          酶量(mg/ml)   IgG量(mg/ml)   酶量
   克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
 
           40,000       160,000   IgG量

 
    (3)本法标记步骤比较简单,重复性好。缺点是酶的利用率低,一般只有2~4%的
 酶与蛋白质结合。
 
 
 
    4. 试剂及器材:
    (1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml, NaCl1.8克,加蒸馏水至200ml。
 
 
    (2)1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml与PH6.8的PBS1ml混合。
 
 
    (3)1M PH9.5碳酸盐缓冲液:取1M碳酸钠3ml与1M碳酸氢钠7ml混合。
 
 
    (4)0.2M赖氨酸溶液:称赖氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸缓冲液1ml中。
 
 
    (5)0.15M PH7.4 PBS及生理盐水。
 
 
    (6)PH7.8饱和硫酸铵溶液及半饱和硫酸铵溶液。
 
 
    (7)萘氏试剂及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
 
 
    (8)纯化的特异性抗体或抗Ig抗体。
 
 
    (9)HRP(RZ>3.0)。

 
    (10) Sephadex G-25层析柱(2cm×50cm)。
 
 
    (11) 搅拌器,分光光度计,离心机
 
 
    (12) 透析袋,大、小烧杯,试管,吸管等。
 
 
 
    简易过碘酸钠法
    本法是以NaIO4先将HRP表面的糖分子氧化成醛基,然后再与Ig上的氨基相结合,所获酶标记抗体的产率高,将近70%的HRP和Ig结合,99%的Ig与酶结合,酶与Ig的活性无重大损失,是目前*常用的方法。
 
 
    1.原理:经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的α-和ε氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP,从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO4氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连,形成斯夫氏硷,后者可进一步用NaBH4(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体。
 
 
    2.标记步骤:
 
 
    (1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。
 
 
    (2)于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20分钟。
 
 
    (3)将上述溶液装入透析袋中,对1mM PH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。
 
 
    (4)加20μl 0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液,使以上醛化?RP的PH升高到9.0~9.5,然后立即加入10mg IgG(抗体,或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。
 
 
    (5)加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2小时。
 
 
    (6)将上述液装入透析袋中,对0.15M PH7.4 PBS透析,4℃过夜。其余步骤(纯化)同戊二醛标记步骤的(6)、(7)、(8)。
 
  
    3.结果判定:
 
 
    除标记物IgG量的计算,略有不同以外,其余均同戊二醛法。IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
 
  
    4.试剂及器材:

 
    (1)0.1M NaIO4:称取241mg高碘酸钠(广州化学试剂厂,批号830602)溶于蒸馏水10ml中。
 
 
    (2)1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:
       0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
     0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
     加蒸馏水至2,000ml。
 
 
    (3)0.2M PH9.5碳酸盐缓冲液:
        Na2CO3 0.32克
        NaHCO3 0.586克
        加蒸馏水至50ml
   再用蒸馏水作20倍稀释,即成0.01M PH9.5的碳酸盐缓冲液。
 
 
    (4)NaBH4溶液(4mg/ml):临用时称取NaBH44mg溶于1ml蒸馏水中。
 
   
    (5)其它的试剂及器材可参见戊二醛标记法。
 
 
    三、工作浓度的选择
    在免疫酶技术中,首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化,便可导致试验结果产生很大的波动。另外,由于浓度过高,可使非特异性反应增加,而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此,正式试验前必须准确滴定其工作浓度。
 
 
    酶标记抗体的滴定方法是:将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上,然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应,以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价,或称工作浓度。
 
 
    其步骤为:先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右,于聚苯乙烯板孔内加0.1ml,4℃过夜,次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100,1∶200,1∶400,1∶800,1∶1600??(根据据抗体的滴度而定),分别加入反应孔中,每个稀释度二孔,每孔0.1ml,37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液,每孔0.1ml,37℃10~30分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。
 
 
    结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标,结合物浓度为横座标,绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右,且曲线斜率*时的酶标抗体稀释度,即为该标记物的工作浓度。
 
 
    有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。
 
 
    要说明的是,本法为ELISA直接法,所测的工作浓度与在实际应用中的*适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统中,因此基础上还应进一步确定实际工作浓度(可采用方阵法),以达到*适的实验条件。
 
 
 
    四、注意事项
    1.在具备高质量HRP的条件下,所要标记的抗体也要活性高,效价高(*1∶16),纯度高,亲和力好,这是保证标记物效价高,免疫活性好的首要条件。
 
 
    2.所使用试剂的PH和浓度及用量必须严格掌握。所用试剂,*(或必需)新鲜配制。如在戊二醛标记法中所用戊二醛应为新鲜纯品,因戊二醛储存过久可形成缩和体(杂质)。否则,影响标记效果。
 
 
    3.室温搅拌时须避光,室内温度一般在25℃为宜。标记物每次透析前,须认真检查,防止漏液。
 
 
    4.浓的标记物相当稳定,常加入30~40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1~2年,但稀释成1∶10,只能保存数周。已配制的使用液应在12小时内用完。切忌反复冻融。

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